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标准的PCR实验室如何建立?

更新时间:2024-04-01      点击次数:379
  齐全的实验室配套设施是保证实验工作的必要条件。根据各实验室不同的实验内容,配备相应的设备和仪器,如超净工作台、离心机、进样器等。
 
  PCR实验室是分子诊断的基础,也是PCR实验的重要场所。它可以通过扩增病毒所含的基因来检测一些病毒含量较低的感染者是否含有特定病毒。近年来,分子诊断行业发展迅速,已广泛应用于医院临床诊断、病原菌检测、各防疫检测部门禽病诊断等。但这种实验需要一个能保证绝对安全、配置合理、操作非常规范的实验室。
 
  今天的文章将从临床基因扩增检测实验室的楼层布局、空调通风系统设计、气流控制和污染防治等方面来阐述实验室设计的主要特点。
 
  

 


 
  一、PCR实验室平面布局
 
  PCR实验室原则上分为四个独立的工作区域:试剂储存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物制备以及扩增区和扩增产物分析区。为避免交叉污染,进入各工作区域必须严格从一个方向进入,即只能从试剂储存和制备区→标本制备区→扩增反应混合物制备和扩增区→扩增产物分析区进入。
 
  实验区域之间试剂和样品的传递应通过传递窗进行。
 
  二、实验室空调通风系统设计及压力控制
 
  PCR实验室没有严格的净化要求,但为了避免各实验区域之间交叉污染的可能性,建议采用全送风、全排风的气流组织。同时,必须严格控制送风和排风的比例,保证各实验区的压力要求。
 
  
  1.试剂贮存和准备区
 
  本实验区的主要操作是储存试剂的制备、试剂的包装和主反应混合物的制备。标本制备所用的试剂和材料应直接运输至该区域,不得途经其他区域。该区域必须存放试剂原料,并在此区域准备所需的储存试剂。
 
  该区对气流压力的控制没有严格要求。
 
 
  2.标本制备区
 
  该领域的主要操作是临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)的提取和储存,以及将其添加到扩增反应管中并测量RNA时合成cDNA。 。
 
  该区域的压力梯度要求为:相对邻近区域为正压,避免气溶胶污染从邻近区域进入该区域。此外,由于操作过程中可能会发生气溶胶污染,因此应避免在该区域进行不必要的移动。
 
 
  3.扩增反应混合物配制和扩增区
 
  该区域的主要操作是DNA或cDNA扩增。此外,准备好的DNA模板和合成的cDNA(来自样品制备区域)的添加以及主反应混合物(来自试剂储存和制备区域)到反应混合物中的制备也可以在该区域中进行。在巢式 PCR 检测中,通常必须在第一轮扩增后打开反应管。因此,嵌套扩增污染风险较高,第二次加样必须在此区域进行。
 
  该区域的压力梯度要求为:相对邻近区域为负压,以防止气溶胶从该区域泄漏。为避免气溶胶造成污染,应尽量减少该区域不必要的活动。添加样品等单独操作应在超净工作台中进行。
 
 
  4.扩增产物分析区
 
  该区域的主要操作是扩增片段的测量。若采用全自动密闭分析仪器检测,则无需设置该区域。
 
  该区域是扩增产物的主要污染源,因此该区域的压力梯度要求为:相对邻近区域为负压,以防止扩增产物从该区域扩散到其他区域
 
  三、污染的预防与控制
 
  PCR实验室设计的核心问题是如何避免污染。在实际工作中,常见的污染类型有: 扩增产物的污染;天然基因组 DNA 的污染;试剂污染和标本之间的污染。一旦发生污染,必须停止实验,直至找到污染源,实验结果必须作废,并重新进行实验。因此,污染发生后,在实验室寻找污染源不仅费时、繁琐,而且浪费人力、物力。因此,要避免污染,首先要预防,而不是消除。
 

 
  1.工作区域的严格划分
 
  (1)合理设置各实验区。
 
  (2)每个实验区域必须有明显的标识(如醒目的门号或不同的地板颜色等),避免不同实验区域的设备、物品、试剂等混淆。
 
 
  2.合理的系统设置
 
  (1)合理的空调、通风系统设置,尽量采用送排风充分的空调系统。
 
  (2)严格的气流压力控制,保证不同实验区域不同的压力要求。
 
 
  3.规范的操作
 
  (1)临床基因扩增检测实验室技术人员必须经过岗位培训。通过培训后才能从事临床基因扩增检测。
 
  (2)实验操作过程中,操作人员必须戴手套并经常更换。此外,操作时使用一次性瓶盖也是防止污染的有效措施。
 
  (3)清洁工作及时、正确。实验工作完成后,必须立即清理该区域。一些实验器具除了用常规消毒液擦拭表面或用紫外线消毒外,还应采用高压消毒。
 
 
  4.严格的管理
 
  (1)严格控制人员进出实验室。与实验无关的人员不得随意进出实验室。如有可能,整个实验区必须设置独立的通道和门
 
  (2)各实验区域使用有明显区分标志(如不同颜色)的工作服,工作人员离开时,不得将该区域的工作服带到其他区域。
 
  (3) 尽量减少实验区内不必要的活动,减少交叉污染的可能性
 
  (4)扩增产物分析区是扩增产物污染的主要来源,废液不能倾倒在实验室内,必须用消毒液浸泡消毒后弃出实验室。用过的移液器吸头和其他一次性材料也应该用消毒剂浸泡消毒,然后统一处理,例如焚烧
 
  (5)扩增产物分析实验室中可能会使用某些致突变、有毒物质,因此应特别注意实验人员的安全。
 

 
  5.完备的实验室配套设施
 
  齐全的实验室配套设施是保证实验工作的必要条件。根据各实验室不同的实验内容,配备相应的设备和仪器,如超净工作台、离心机、进样器等。
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